Las guías de ARN modificadas mejoran la selección de genes para las herramientas y terapias CRISPR de próxima procreación – ScienceDaily

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En los últimos esfuerzos en curso para expandir las tecnologías para modificar los genes y su expresión, los investigadores del laboratorio de Neville Sanjana, PhD, en el Centro del Genoma de Nueva York (NYGC) y la Universidad de Nueva York (NYU) han desarrollado un ARN guía químicamente modificado para un Sistema CRISPR que se dirige al ARN en lugar de al ADN. Estos ARN guía modificados químicamente mejoran significativamente la capacidad de apuntar, rastrear, modificar y / o descomponer el ARN en las células humanas.

En un estudio publicado hoy en Biología química celular, el equipo explora una serie de modificaciones de ARN diferentes y detalla cómo las guías modificadas aumentan la eficiencia de la actividad CRISPR de 2 a 5 veces en comparación con las guías no modificadas. También muestran que los cambios químicos optimizados extienden la actividad de focalización de CRISPR de 48 horas a cuatro días. Los investigadores trabajaron en colaboración con científicos de Synthego Corporation y New England BioLabs, reuniendo a un equipo diverso con experiencia en la purificación de enzimas y la química del ARN. Para aplicar estas modificaciones químicas optimizadas, el equipo de investigación se centró en los receptores de la superficie celular en las células T humanas de donantes sanos y en un segmento «universal» de la secuencia genética compartida por todas las variantes conocidas del virus SARS-COV-ARN. Pandemia de COVID-19.

Aumentar la eficiencia y la «vida» de las guías CRISPR-Cas13 es de suma importancia para los investigadores y desarrolladores de fármacos, ya que permite una mejor eliminación de genes y más tiempo para estudiar cómo el gen afecta a otros genes en vías relacionadas.

«La entrega de la guía CRISPR ARN puede ser un desafío, con un tiempo de eliminación limitado debido a la rápida degradación de la guía. Nos inspiraron las modificaciones de la guía desarrolladas para otros CRISPR dirigidos al ADN y queríamos probar si las guías modificadas químicamente podrían mejorar el tiempo de eliminación para CRISPR dirigido a ARN-Cas13 en células humanas ”, dice Alejandro Méndez-Mancilla, PhD, científico postdoctoral en el laboratorio y co-primer autor del estudio.

Sobre la base del estudio anterior del laboratorio que describió los principios para el diseño óptimo de la guía Cas13, publicado en Biotecnologías naturales En marzo de 2020, los investigadores aplicaron y probaron sistemáticamente una serie de modificaciones químicas. Por ejemplo, descubrieron que la adición de 3 bases con un tipo diferente de enlace químico que las une (modificación del fosforotioato) amplía la capacidad de romper el objetivo del ARN por varios días en una línea celular humana. En las células T primarias, la modificación del fosforotioato resultó en una disminución del 60-65% de la expresión de CD46, un receptor involucrado en la regulación del sistema inmunológico, en comparación con una disminución del 40-45% cuando se utilizó una guía no modificada.

El equipo también descubrió que algunos cambios en la metilación y el terminador invertido también mejoraron la actividad de Cas13. Para todas las modificaciones, la ubicación de estas bases de ARN modificadas también fue crucial. Si se coloca incorrectamente, los cambios llevaron a que el ARN guía no funcionara. «Esperamos que la eficacia y la estabilidad mejoradas de estas guías CRISPR Cas13 modificadas ayuden a allanar el camino para el uso de CRISPR dirigidos al ARN en células primarias», dice Hans-Hermann Wessels, PhD, científico postdoctoral en el laboratorio. co-primer autor del estudio.

«Estas guías revisadas amplían aún más la caja de herramientas de ingeniería del genoma y del transcriptoma. En el caso de los elementos no codificantes del genoma humano, la selección de ADN puede no ser eficaz y otros organismos, como los virus de ARN, como el coronavirus o la gripe, no pueden dirigirse en absoluto». dijo el Dr. Sanjana, miembro principal de la facultad, NYGC, profesor asistente de biología, NYU y profesor asistente de neurociencia y fisiología, NYU Grossman School of Medicine, autor principal del estudio.

La prueba del equipo para descomponer el segmento de secuencia principal universal del virus de ARN SARS-CoV-2 en células humanas, por ejemplo, solo es posible utilizando un CRISPR dirigido a ARN como Cas13. El SARS-CoV-2 ingresa a las células y libera su genoma de ARN, que luego se transcribe en ARN más pequeños, denominados ARN subgenómicos. Estos ARN subgenómicos son los encargados de producir las diferentes proteínas necesarias para que el virus se replique y así infecte otras células. La secuencia líder universal se encuentra al comienzo de cada ARN subgenómico. Por lo tanto, un enfoque eficaz para dirigirse a la secuencia líder universal puede proteger a las células de una mayor replicación y de infecciones virales.

También es de suma importancia la capacidad de CRISPR-Cas13 para modular la expresión génica sin alterar permanentemente la secuencia del genoma del ADN subyacente, así como CRISPR dirigidos al ADN como Cas9 o Cas12a. «La modulación transitoria para estimular los resultados de la expresión génica a menudo se prefiere en la investigación biomédica y el desarrollo de fármacos. Por ejemplo, las vacunas de ARN mensajero para el SARS-CoV-2 expresan transitoriamente pero crean una memoria inmunológica que dura más allá de su propia duración de expresión», observa el Dr. . Sanjana.

Coautores de la Biología química celular el estudio incluye Mateusz Legut, PhD, un científico postdoctoral en el laboratorio; Anastasia Kadina, PhD, científica senior, investigación química, Synthego Corporation; Megumu Mabuchi, científico asociado, edición del genoma y biología del ARN, New England BioLabs; John Walker, PhD, Director de Investigación Química, Synthego Corporation; G. Brett Robb, PhD, director científico, edición de ARN y genoma, y ​​Kevin Holden, PhD, jefe de ciencia, Synthego Corporation.

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