Molécula pequeña induce la recitación de mutaciones sin sentido de CFTR en la fibrosis quística

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Un fármaco en investigación informado en Comunicaciones de la naturaleza sugiere que un «camino es claramente factible» para tratar los casos actualmente intratables de enfermedad de fibrosis quística causada por mutaciones sin sentido. Esto incluye aproximadamente el 11% de los pacientes con fibrosis quística, así como pacientes con otros trastornos genéticos, incluida la distrofia muscular de Duchenne, la talasemia y numerosos cánceres, también causados ​​por mutaciones sin sentido.

El fármaco es una molécula pequeña con un mecanismo de acción novedoso, dicen David Bedwell, Ph.D., y Steven Rowe, MD, MSPH, coautores principales. Bedwell es profesor y presidente de la Universidad de Alabama en el Departamento de Bioquímica y Genética Molecular de Birmingham, y Rowe es profesor en el Departamento de Medicina de la UAB.

Para comprender cómo una mutación sin sentido causa una enfermedad, y cómo funciona el fármaco experimental para suprimir la mutación, es necesario observar de cerca el mecanismo biológico que produce proteínas dentro de una célula.

Una proteína es una cadena de cientos de aminoácidos que luego se pliega en su forma correcta y se mueve al lugar correcto para realizar su función. La cadena está formada, anillo por anillo, de ribosomas que leen una secuencia de la proteína transportada por el ARN mensajero. Esa secuencia indica cuál de los 20 aminoácidos diferentes agregar a cada enlace, uno por uno.

En la enfermedad de la fibrosis quística, las mutaciones afectan la proteína CFTR que actúa en la superficie de las células pulmonares para regular el flujo de agua al moco. Un CFTR defectuoso o ausente crea una mucosidad muy pegajosa que permite infecciones pulmonares. Una mutación genética que cambia una de las bases de nucleótidos del ARN mensajero puede provocar la inserción de un aminoácido incorrecto en la cadena de proteínas, alterando su función. Los codones de terminación prematura sin sentido estudiados por Bedwell y Rowe causan un problema diferente: la mutación obliga al ribosoma a detener la síntesis de proteínas a mitad de camino, produciendo una proteína incompleta. También causa una descomposición del ARNm mediada sin sentido.

Por lo tanto, Bedwell, Rowe y sus colegas querían encontrar compuestos de moléculas pequeñas que destruyeran el ribosoma a través de la mutación de detención prematura sin sentido, permitiendo que el ribosoma continuara la síntesis completa de proteínas. Esperaban encontrar agentes de lectura completa que tuvieran un nuevo mecanismo y funcionaran mejor que los actuales, como los antibióticos aminoglucósidos, que tienen poca eficacia.

Los investigadores utilizaron células de rata que portaban un gen modificado de un camarón de aguas profundas para probar cientos de miles de compuestos. El gen codifica la luciferasa NanoLuc, pero con una modificación para colocar un codón de terminación prematura en el medio del gen. Una pequeña molécula que hace que el ribosoma lea a través de la detención prematura produciría luciferasa intacta, haciendo que las células brillen con una luminiscencia brillante.

Este gen reportero permitió a un equipo de Southern Research probar 771,345 compuestos utilizando un cribado de alto rendimiento. De los 180 compuestos que exhibieron actividad de lectura, la molécula pequeña SRI-37240 fue la más activa.

Los investigadores encontraron que SRI-37240 restauró la función de los genes CFTR humanos con mutaciones de codones de terminación prematura, como se probó en cultivos de células de rata. Aumentó significativamente la cantidad de proteína CFTR y aumentó ligeramente la cantidad de ARN mensajero de CFTR. Se sabe que un aminoglucósido llamado G418 ayuda a leer las mutaciones prematuras de codones, y los investigadores encontraron que SRI-37240 y G418 trabajaron sinérgicamente para restaurar la función CFTR.

Descubrieron que SRI-37240 induce una pausa prolongada en los codones de terminación del ARN mensajero e inhibe la terminación de la síntesis de proteínas en los codones de terminación prematura sin estimular la lectura completa en los codones de terminación normales que se encuentran al final de la secuencia que codifica la proteína en el ARN mensajero.

Los químicos medicinales sintetizaron 40 derivados de SRI-37240 y uno, SRI-41315, fue más potente y exhibió mejores características fisicoquímicas. En líneas celulares humanas con el gen indicador NanoLuc, SRI-41315 mostró una eficiencia de lectura mucho mayor que SRI-37240 y SRI-41315 actuaron sinérgicamente con G418.

Los complejos ribosomales incluyen proteínas ribosomales y otras proteínas que funcionan como factores de terminación, factores de traducción y factores de desintegración del ARNm mediado sin sentido. Los investigadores observaron la abundancia de siete de esas proteínas y encontraron que SRI-41315 redujo drásticamente un factor de terminación único llamado eRF1, a través de una vía dependiente de la degradación del proteasoma. Este nuevo mecanismo no se había visto previamente para un agente farmacológico.

Para predecir la eficacia clínica de la fibrosis quística, los investigadores probaron células epiteliales bronquiales humanas primarias que tenían codones de terminación prematura CFTR endógenos. Ni SRI-37240 ni SRI-41315 solos aumentaron la función de CFTR, pero SRI-41315 junto con G418 mostraron un aumento significativo en la función.

Esto es un progreso, dicen Bedwell y Rowe, pero los obstáculos persisten. Desafortunadamente, los dos compuestos tuvieron un efecto deletéreo sobre la conductancia iónica mediada por el canal de sodio epitelial, lo que limita el desarrollo en su forma actual como tratamiento para la fibrosis quística. El ya conocido efecto de lectura de los aminoglucósidos también es limitado porque estos antibióticos no restauran los niveles terapéuticos de CFTR, también deben administrarse por vía intravenosa y pueden ser tóxicos.

Bedwell y Rowe dicen que es cada vez más probable que se necesiten múltiples agentes distintos con diferentes mecanismos de acción para impartir una respuesta clínicamente eficaz. Concluyeron: «Si bien se necesita más química médica para identificar compuestos de lectura directa que tengan un impacto máximo en la función CFTR sin efectos secundarios fuera del objetivo, los resultados presentados aquí sugieren que este camino es claramente alcanzable».

Los co-primeros autores del estudio, «Una pequeña molécula que induce la lectura traslacional de mutaciones sin sentido de CFTR por agotamiento de eRF1», son Jyoti Sharma, Departamento de Medicina de la UAB, y Ming Du, Departamento de Bioquímica y Genética Molecular de la UAB.

Otros coautores son Eric Wong, Hermann Bihler, Feng Liang, Jerome Mahiou, Josef Saltz y Martin Mense, Cystic Fibrosis Foundation Therapeutics, Boston, Massachusetts; Venkateshwar Mutyam, Yao Li, Jianguo Chen, Ning Peng y Liping Tang, Departamento de Medicina de la UAB; Kari Thrasher, Kaimao Liu y Kim M. Keeling, Departamento de Bioquímica y Genética Molecular de la UAB; Lianwu Fu, Departamento de Biología Celular, del Desarrollo e Integrativa de la UAB; Jamie Wangen y Rachel Green, Facultad de Medicina de la Universidad Johns Hopkins, Baltimore, Maryland; Bini Mathew, Robert J. Bostwick, Corinne E. Augelli-Szafran y Mark J. Suto, Southern Research, Birmingham, Alabama; Andras Rab, Jeong Hong y Eric J. Sorscher, Emory University, Atlanta, Georgia; y Eric M. Mendenhall y Candice J. Coppola, Universidad de Alabama en Huntsville, Huntsville, Alabama.

El apoyo provino de la Cystic Fibrosis Foundation y subvenciones de los Institutos Nacionales de Salud P30DK072482.

En la UAB, Bedwell tiene la cátedra James C. y Elizabeth T. Lee de bioquímica. Rowe ocupa la Cátedra de Investigación Médica Familiar Nancy R. y Eugene C. Gwaltney y es directora del Centro de Investigación de Fibrosis Quística Gregory Fleming James.

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